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Continuamo il nostro viaggio per capire meglio questo mondo per me molto affascinante : la biologia molecolare.
Forse molti non sanno di come viene eseguito questo importantissimo esame e di tutti i passaggi che esso necessita.
Un corretto utilizzo della tecnica di amplificazione degli acidi nucleici richiede, come già precedentemente accennato, l’uso di specifici accorgimenti per minimizzare da una parte il rischio di contaminazioni e dall’altra quello di falsi negativi dovuti alla degradazione dell’acido nucleico nei campioni da testare. La necessità di introdurre la tecnologia PCR in un laboratorio già condizionato dalle preesistenti attività implica assai spesso una parziale riorganizzazione del lavoro che, pur tenendo conto delle particolari esigenze della PCR, non interferisca eccessivamente con lo svolgimento delle altre attività. Si tratterà quindi di mediare di volta in volta tra l’idea del “laboratorio PCR ideale” e le condizioni logistiche di ciascuna realtà.
Segue una esemplificazione di come in un laboratorio indirizzato prevalentemente alla ricerca clinica o alla diagnostica clinica avanzata (quindi con la necessità di utilizzare tecnologie di biologia molecolare e/o immunologiche su casistiche numericamente considerevoli) possa essere in concreto organizzata l’attività.
Vanno discussi in particolare 4 aspetti:
- la suddivisione delle aree di lavoro
- i comportamenti dell’operatore
- l’organizzazione del lavoro e delle attività di supporto
- la scelta dei controlli positivi e negativi1) Suddivisione delle aree di lavoro
Nel laboratorio vanno individuate 4 aree di lavoro, delle quali tre sono destinate, anche se non in modo
esclusivo, alla esecuzione dei test di PCR. Le aree di lavoro 1, 2 e 3 possono essere intese come ambienti
distinti oppure come “aree” o zone dello stesso ambiente, fisicamente separate. L’area 4 deve comunque
essere localizzata necessariamente in un ambiente diverso.Area 1
Attività PCR:
- preparazione dei reagenti e loro suddivisione in aliquote
- conservazione in freezer o in frigo di aliquote e scorte
- preparazione del mix di retrotrascrizione
- preparazione del mix di PCRStrumentazione:
- microcentrifuga
- freezer/frigorifero
- set di pipette
- eventuale cappa UV
N.B. In quest’area l’operatore dovrà sempre indossare un camice apposito.Area 2
Attività PCR:
- estrazione dei campioni
- innesco delle reazioni di retrotrascrizione
- dispensazione del DNA o del cDNA nel mix di reazione PCRStrumentazione:
- cappa chimica
- centrifuga refrigerata per tubi eppendorf
- blocco termostatato
- bagno termostatato
- vortex
- set di pipette
N.B. E’ opportuno utilizzare set di pipette distinti per tali procedure.Area 3
Attività PCR:
- amplificazione dei campioni
- innesco del secondo ciclo di PCR nel caso di reazioni nested
NB. In quest’area si deve prevedere, in aggiunta al thermal cycler, una zona protetta in cui effettuare
l’innesco delle reazioni nested.Strumentazione:
- thermal cycler(s)
- set di pipette per innescare la reazione nested
- eventuale cappa UVArea 4
Attività PCR:
- corsa dei gel di agarosio per la verifica o per il trasferimento
- trasferimento su nylon/nitrocellulosa
- preparazione spot su filtro
- rivelazione colorimetricaStrumentazione:
- apparati per elettroforesi
- apparato per spot
- apparato per fotografia dei gel
- frigorifero
- set di pipette
- forno a microonde
- spettrofotometro
- lavatori di piastre
NB. E’ in quest’area che andrebbero effettuate tutte le manipolazioni degli amplificati, quali digestioni con enzimi di restrizione, sequenziamento, tecniche di genotipizzazione.2) Comportamenti dell’operatore
a) I trasferimenti dell’operatore dovrebbero svolgersi secondo il seguente flusso:
area 1 —> area 2 —> area 3 —> area 4
Va evitato il ritorno nelle aree 1 e 2 dopo aver lavorato nelle aree 3 e 4. Ciò comporta che l’operatore dovrà riporre e riordinare tutto il materiale usato nell’area 1 e 2 prima di recarsi nelle aree 3 e 4. Inoltre,dovrà portare nelle aree 3 e 4 tutto il materiale da utilizzare in seguito e dovrà, per evitare la necessità di rientrare nelle aree 1 o 2, controllare che aliquote sufficienti di tutti i reagenti necessari siano pronte nelle aree 3 e 4.
b) Usare guanti di lattice monouso; cambiarli frequentemente e per lo meno ogni volta che si accede (o si ritorna)all’area 1. Il frequente ricambio dei guanti riduce le possibilità di trasferimento del DNA amplificabile dalle aree contaminate e fra i campioni.
3) Organizzazione del lavoro e delle attivita’ di supporto
Oltre ai principali aspetti operativi già considerati vanno altresì ricordati i seguenti punti:
a) L’introduzione di tale tecnologia ha reso evidente l’esigenza di individuare aree di lavoro e modalità
di distribuzione del materiale per il lavoro (ad es. pipette), non tanto in funzione del singolo operatore, quanto in funzione del tipo di lavoro svolto (ad es. individuazione dell’area di lavoro per l’estrazione degli acidi nucleici dai campioni in esame). In ciascuna delle aree di lavoro é opportuno utilizzare pipette, puntali e accessori differenti specificamente destinati.
b) Utilizzare materiale a perdere e, al fine di minimizzare il rischio di dispersione accidentale di reagenti
o amplificati preferire provette con tappi a scatto che non oppongano resistenza all’apertura per evitare
di schizzare il liquido in esse contenuto. Comunque, prima di ogni apertura può essere utile una
brevissima centrifugazione in microcentrifuga (5 secondi) per avere tutto il liquido al fondo della provetta.
c) Il canale interno delle pipette rimane pressochè inevitabilmente contaminato da aereosol contenenti
DNA con conseguente cross-contaminazione. A scopo preventivo possono essere utilizzate pipette a
spiazzamento positivo con puntali monouso o puntali con filtro incorporato.
d) E’ consigliabile, per ridurre il numero di campionamenti e quindi il rischio di contaminazione durante
gli stessi, preparare numerose aliquote di ciascuno dei reagenti. La preparazione delle aliquote e
la loro conservazione deve essere effettuata in un’area non contaminata da prodotti di amplificazione.
Se si procede alla produzione autonoma degli oligonucleotidi da utilizzare per l’amplificazione,
questi devono essere sintetizzati e purificati in un ambiente libero da prodotti di amplificazione. E’ consigliabile registrare sempre il lotto di origine delle aliquote conservate, allo scopo di poter risalire piu’ facilmente alle eventuali fonti di contaminazione.
e) Particolari precauzioni devono essere adottate ancor prima di iniziare le procedure sperimentali direttamente
connesse alla PCR e cioè al momento del prelievo e della preparazione dei campioni biologici
da testare (ad es. sieraggio entro due ore dal prelievo con pipette e materiali monouso; conservazione
in aliquote a -20°C o preferibilmente a -70°C).
f) Mescolare i reagenti per la PCR in anticipo in una soluzione “premix” (nel caso di kit commerciali tale
mix può essere fornito già pronto) che successivamente può essere dispensata nelle provette di reazione
ove sarà aggiunto anche il DNA da amplificare. In questo modo vengono ridotti al minimo i
trasferimenti dei campioni e le conseguenti possibilità di contaminazione sporadica.
g) Aggiungere il DNA o il cDNA sempre al termine della fase di preparazione della reazione PCR. Allo
scopo di ridurre al minimo le possibilita’ di trasferimento accidentale di DNA durante la manipolazione
dei reagenti, componenti come i dNTP, gli oligonucleotidi, il tampone, l’enzima e l’olio minerale
devono essere aggiunti prima del campione di DNA da amplificare. In tal modo sono minimizzate
le possibili cross-contaminazioni.
h) Nel caso di metodiche che non utilizzano kit commerciali è assolutamente indispensabile limitare a
non più di 10 il numero di campioni trattati in ogni seduta. Anche nell’utilizzazione di kit commerciali
andrebbe standardizzato e possibilmente limitato il numero di campioni da analizzare in ogni
dosaggio.
i) E’ opportuno lavorare in condizioni di pulizia ai fini non solo di limitare la diffusione dell’amplificato,
ma anche di evitare di perdere l’acido nucleico per l’esposizione ad agenti degradanti. A tal fine
sarà utile:
- autoclavare l’acqua deionizzata e le soluzioni che possono essere autoclavate senza che ne siano
modificate le prestazioni. Devono essere autoclavati anche i puntali e le provette da microcentrifuga.
Non autoclavare i dNTP e le DNA polimerasi termostabili (Taq o altro);
- riporre sempre il materiale da utilizzare (puntali, tubi eppendorf, tubi per amplificazione etc.) in
contenitori a chiusura ermetica ed autoclavabili o comunque in spazi chiusi per evitare l’esposizione
alla polvere;
- pulire regolarmente tutte le apparecchiature che comunque possono venire in contatto con i campioni,
i reagenti o gli amplificati (centrifughe, apparecchi per il vuoto, bagnetti termostatati, contenitori per il ghiaccio, superfici esterne dei frigoriferi, maniglie delle porte etc.) con HCl 1M, NaOH 1N o candeggina al 10%. Se si osservano gel di agarosio con amplificati su trans-illuminatore UV questo va ricoperto con un nuovo foglio di pellicola trasparente per ogni singolo gel osservato.
l) E’ consigliabile mettere in opera un efficace sistema di controllo delle scorte di materiale d’uso e di reagenti (ad es. un registro in cui venga cancellato il materiale che passa all’uso corrente) al fine di evitare interruzioni dell’attività o “soluzioni d’emergenza” con utilizzazione di reagenti o materiali non destinati alla PCR e di cui non è garantita la conservazione e/o l’utilizzazione in condizioni PCR.
m) Organizzare la pulizia del laboratorio (ad eccezione di banconi e apparecchiature di pertinenza dell’operatore)
al fine di evitare che questa possa divenire fonte ed occasione di diffusione degli amplificati.
4) Scelta dei controlli positivi e negativi
In ogni esperimento va previsto sempre almeno un campione senza l’aggiunta di DNA, quale controllo
di contaminazione dei reagenti utilizzati nel singolo esperimento di amplificazione. E’ consigliabile che
uno di tali controlli “non DNA” venga assemblato per ultimo, dopo gli altri tubi di reazione, al fine di
avere un controllo che rifletta l’insieme delle manipolazioni effettuate nel singolo esperimento o gruppo
di dosaggi.
Oltre al controllo negativo di reazione contenente solo i reagenti dell’esperimento, aggiungere sempre almeno un campione biologico certamente negativo (ideale sarebbe aggiungerne uno ogni 4-5 campioni da esaminare) ed almeno uno certamente positivo, da considerare quali controlli dell’efficienza delle procedure di estrazione degli acidi nucleici e, nel caso di cDNA-PCR, della tappa di retrotrascrizione. Può essere utile includere, sempre nel caso di una cDNA-PCR, anche un campione in cui non viene aggiunto l’enzima trascrittasi inversa, quale ulteriore controllo per una eventuale contaminazione con DNA amplificati.
Anche se i suggerimenti proposti riducono i rischi di errore non è comunque possibile eliminare in modo assoluto la eventualità di contaminazioni sporadiche o di errori dell’operatore. Può essere utile a tal fine che periodicamente un certo numero di campioni selezionati casualmente venga riesaminato da un secondo operatore e ciò anche nel caso si utilizzino kit commerciali.
Spero di non avervi annoiato....... in parole povere, è quanto succede in un laboratorio, per questo motivo è importantissimo attenersi alle regole
Luca
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- Gea.
User deleted
Anche se i suggerimenti proposti riducono i rischi di errore non è comunque possibile eliminare in modo assoluto la eventualità di contaminazioni sporadiche o di errori dell’operatore. Può essere utile a tal fine che periodicamente un certo numero di campioni selezionati casualmente venga riesaminato da un secondo operatore e ciò anche nel caso si utilizzino kit commerciali.
Spero di non avervi annoiato....... in parole povere, è quanto succede in un laboratorio, per questo motivo è importantissimo attenersi alle regole
Grazie Luca, la parte tecnica non la capisco, l'unica cosa che so di certo è che dev'essere un protocollo organizzativo e uno operativo, che devono essere rispettati per ridurre al massimo quella percentuale di rischio errore.......per quanto vogliamo, è impossibile pensare all'assoluta perfezione.. -
Maria luisa arantes.
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Fiz o exame de carga viral da hepatite C gostaria de saber se esta bom.O resultado e esse HCV-Quantificação(lLog)5,56 HCV-RNA UI/ml 360.710 Aguardo a resposta Obrigada. 
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Olá Maria Luisa é uma baixa viremia, mas está a ser tratado?
Luca. -
hypertak.
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Ciao Maria benvenuta !
La tua viremia è considerata bassa.Se devi fare una terapia è un buon predittore di Svr. (Guarigione)
Ciao..
ESECUZIONE DELLA PCRREGOLE DA ADOTTARE |
